II massimo rappresentante della scuola romana fu Pierluigi da Palestrina (1525 ca.-1594), che ancora in vita fu esaltato come il "principe della musica" e come tale ebbe grandi onori. Il suo merito principale fu di aver saputo utilizzare tutte le finezze della polifonia fiamminga, adattandole però al carattere della scuola romana, basato sullo stile "a cappella" (cioè per sole voci, senza accompagna­mento di strumenti), e soprattutto di aver eliminato gli eccessi virtuosistici, rispondendo così ai suggerimenti del Concilio di Trento. Palestrina fu amico di San Filippo Neri (1515-1595) il cui nome è legato a un altro tipo di musica sacra di carattere più popolare: l'Oratorio, un genere di rappresentazione sacra derivante dalla Lauda. 

San Filippo Neri fu il fondatore dell'ardine dell'Oratorio": raccogliendo sotto la sua protezione gli orfani e i poveri cominciò a intro­durre nella pratica delle preghiere quotidiane dapprima i canti, poi i cori e infine vere e proprie rappresentazioni a carattere religioso, al fine di coinvolgere i suoi protetti.

La scuola veneziana

La scuola veneziana si sviluppò agli inizi del Cinquecento grazie al maestro fiammingo Adriano Willaert (1490 ca.-1562), i cui maggiori continuatori furono Andrea Gabrieli (1510 ca.-1586) e il nipote Giovanni Gabrieli (1554-1612). La musica sacra seguì a Venezia linee diverse rispetto a quella romana. Molta importanza ebbe un fatto apparentemente secondario, e cioè che la famosa basilica di San Marco fosse l'unica chiesa del tempo ad avere due cantorie, l'una di fronte all'altra (la cantoria è appunto lo spazio riservato ai cori): questo fatto indusse gli organisti della chiesa a creare composizioni in cui i cori si alternavano quasi come nei moderni dischi stereofonici. Tali composizioni sono indicate con il nome di cori spezzati o cori battenti. 

Un'altra importante novità fu data dalla presenza costante degli strumenti musicali, primo fra tutti l'organo che, grazie anche a grandi esecutori, sarebbe ben presto divenuto il re degli strumenti. Fu proprio per la diffusione di strumenti come l'organo che nella seconda metà del Cinquecento si determinò una fondamentale novità per tutta la musica successiva; al posto della polifonia ci fu l'utilizzazione di una linea melodica unica accompagnata da suoni emessi contemporaneamente dagli strumenti, gli accordi, definiti secondo le leggi dell'armonia fissate per la prima volta da Gioseffo Zarlino (1517-1590). Nella pratica queste novità si espressero nell'uso del bosso continuo, una specie di accompagnamento a base di accordi eseguiti da strumenti, mentre alla voce umana era affidata la melodia.  Uno dei primi a fame uso fu Adriano Banchieri (1567-1634)

La Scuola fiorentina

A differenza di quanto accadde a Venezia e a Roma, durante il Cinquecento prevalse a Firenze la musica polifonica profana, sotto due forme: quella di tipo popolare (di cui sono esempio i Canti carnascialeschi, risalenti al Quattrocento e dei quali si è già parlato, la Villanella, che potrebbe essere considerata come l'antenata della moderna canzonetta, e il Balletto) e quella di origine colta (esemplificata dal Madrigale). 

La Villanella, probabilmente di origine napoletana, si sviluppò come forma popolare, spesso su testi dialettali, in contrapposizione al carattere fiorito e raffinato del Madrigale. Verso la fine del Cinquecento si evolse sia nello stile sia nel contenuto letterario, trovando insigni cultori anche tra i madrigalisti, come nel caso di Luca Marenzio.

Il Balletto designava una forma vocale popolare a 3 o a 5 voci, spesso isoritmica e con caratteri di danza. Nei balletti a 5 voci ricorrevano parti vocalizzate sulle sillabe FA LA LA LA che imitavano un ipotetico accompagnamento strumentale: erano forse queste le parti destinate al ballo. Famosi sono i balletti a 5 voci di Giacomo Gastoldi pubblicati nel 1591. 

Il Madrigale, infine, fu la forma polifonica profana più importante nella Firenze rinascimentale. Sviluppatesi dalla Frottola quattrocentesca, poteva essere a 3, 4 o 5 voci ed ebbe tendenza a trovare un'adeguata espressione nei versi di grandi poeti del tempo, come Ludovico Ariosto e Torquato Tasso, o del passato, come Petrarca e Dante. Il Madrigale rappresentò l'apice di tutte le forme profane precedenti, riuscendo a sviluppare una polifonia agile ed espressiva, alternando episodi contrappuntistici, più o meno complicati, con altri "armonizzati". All'inizio del Seicento, poi, accolse lo stile drammatico e concitato dei Madrigali del Monteverdi, che già facevano presagire uno sviluppo monodico con accompagnamento strumentale. Da ricordare è anche il Madrigale rappresentativo o dialogico, che consisteva in una serie di composizioni narranti una vicenda quasi sempre allegra e popolare. 

Questa forma di Madrigale può essere considerata, unitamente all'Oratorio, come un primo nucleo del Melodramma, nuovo genere alla cui nascita contribuì un gruppo di musicisti e letterati che a Firenze si riuniva nella casa del conte Bardi: i componenti della Camerata dei Bardi.

Nell'intento di far rivivere lo spirito delle antiche tragedie greche, spettacoli in cui si alternavano parti cantate e parti recitate dagli attori, costoro giunsero a elaborare monodie accompagnate, ovvero narrazioni musicali realizzate da un "recitar cantando" accompagnato dal liuto o da altri strumenti. Il "recitar cantando", che poi si trasformerà nel Melodramma, fu elaborato soprattutto da Giulio Caccini, Emilio de Cavalieri, Jacopo Peri e Vincenzo Galilei, tutti appartenenti alla "Camerata".